Trong thi�n nhi�n c�c hợp chất anthranoid c� thể tồn tại dưới dạng oxyho� [anthraquinon] hoặc dạng khử [anthranol, anthron], dạng tự do [aglycon] hoặc dạng kết hợp [glycosid].
C�c hợp chất anthranoid khi t�c dụng với kiềm [amoniac, natri hydroxyd hoặc kali hydroxyd] sẽ tạo c�c dẫn chất phenolat c� m�u đỏ sim tan trong nước, ri�ng acid chrysophanic kh�ng phản ứng với amoniac. Chỉ c� c�c dẫn chất anthraquinon cho m�u đỏ, c�c dẫn chất khử muốn cho m�u đỏ phải chuyển th�nh dạng oxyho� bằng c�ch cho t�c dụng với c�c chất oxyho� như H2O2, FeCl3 [trước khi tiến h�nh phản ứng], hoặc dung dịch kiềm n�ng. Th�ng thường hay định t�nh dưới dạng tự do được chiết ra bằng một dung m�i hữu cơ [ether hoặc cloroform], khi t�c dụng với dung dịch kiềm, to�n bộ c�c hợp chất anthranoid sẽ chuyển sang dạng phenolat c� m�u đỏ sim v� tan trong lớp nước. Muốn định t�nh dạng glycosid c� thể chiết xuất bằng nước rồi cho t�c dụng với dung dịch kiềm ta sẽ c� một chất lỏng m�u n�u đỏ rất kh� ph�n biệt với những tạp chất kh�c. Thường người ta thuỷ ph�n trước khi l�m phản ứng v� như vậy ta sẽ định t�nh c�c hợp chất anthranoid to�n phần [cả dạng tự do v� dạng glycosid]. M�u của phản ứng n�y sẽ đậm hơn nhiều so với m�u của phản ứng định t�nh dạng tư. do.
�ịnh t�nh dang tự do
Chiết xuất:
Lấy một lượng dược liệu th�ch hợp cho v�o ống nghiệm lớn [10ml]. Th�m 5ml nước cất. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến s�i. Lọc dịch chiết c�n n�ng qua giấy lọc hoặc qua một lớp b�ng mỏng v�o trong b�nh gạn dung t�ch 50ml. L�m nguội dịch lọc. Th�m 5ml ether [hoặc cloroform]. Lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước. Giữ lớp ether [hoặc cloroform] để l�m phản ứng.
Tiến h�nh phản ứng:
- Lấy 1ml dịch chiết ether [hoặc cloroform] cho v�o ống nghiệm nhỏ. Th�m 1ml dung dịch amoniac 10%. Lắc nhẹ. Lớp nước sẽ c� m�u đỏ sim. Nếu lớp ether [hoặc cloroform] c� m�u v�ng chứng tỏ trong dược liệu c� chứa acid chrysophanic. Th�m tiếp tục từng giọt dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp dung m�i hữu cơ sẽ mất m�u v�ng, c�n lớp nước sẽ đỏ thẫm hơn l�c ban đầu.
- Lấy 1ml dịch chiết ether [hoặc cloroform] cho v�o ống nghiệm nhỏ. Th�m 1ml dung dịch NaOH 10%, lắc nhẹ. Lớp nước sẽ c� m�u đỏ sim.
- Lượng dược liệu th�ch hợp cho phản ứng:
Đại ho�ng: 0,5g
Cốt kh� củ, Thảo quyết minh, H� thủ � đỏ: 1g
�ịnh t�nh anthranoid to�n phần [dạng glycosid v� dạng tự do]
Cho v�o ống nghiệm lớn một lượng dược liệu th�ch hợp. Th�m 5ml dung dịch acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp tr�n nguồn nhiệt đến s�i. Tiếp tục lọc v� chiết như ở tr�n.
- Lấy 1ml dịch chiết ether [hoặc cloroform], th�m 1ml dung dịch amoniac. Lắc nhẹ. Lớp nước sẽ c� m�u đỏ sim. Nếu lớp ether c� m�u v�ng th� tiếp tục nhỏ từng giọt dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp ether sẽ mất m�u c�n lớp nước th� m�u sẽ đỏ đậm hơn.
- Lấy 1ml dịch chiết ether [hoặc cloroform] cho v�o ống nghiệm nhỏ. Th�m 1ml dung dịch NaOH 10%. Lắc nhẹ. Lớp nước sẽ c� m�u đỏ sim.
Ghi ch�:
Với dược liệu H� thủ � đỏ, muốn phản ứng l�n r� hơn c� thể tiến h�nh như sau:
Lấy khoảng 0,5g bột dược liệu. Th�m 5ml dung dịch NaOH 2% trong ethanol. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến s�i. Pha lo�ng với đồng lượng nước cất. Lọc n�ng dung dịch v�o trong b�nh gạn dung t�ch 50ml. Acid h�a đến phản ứng acid nhẹ. Th�m 5ml ether. Lắc mạnh. Tiến h�nh phản ứng định t�nh với dịch chiết ether như đ� n�u ở tr�n.
- �ịnh t�nh c�c hợp chất anthranoid bằng sắc k� lớp mỏng
- Dung dịch thử: Lấy 0,1g bột dược liệu [Đại ho�ng] cho v�o b�nh n�n, th�m 30ml nước cất v� 1ml acid hydrocloric đậm đặc [TT] đun c�ch thủy 15 ph�t. Để nguội, lọc, lắc dịch lọc với 25ml ether [hoặc cloroform]. Gạn lấy lớp ether [hoặc cloroform], lọc qua natri sulfat khan. Bốc hơi dịch ether [hoặc cloroform] đến cắn. H�a tan cắn bằng 1ml cloroform.
- Dung dịch đối chiếu: H�a tan acid chrysophanic trong cloroform, nếu kh�ng c� chất chuẩn đối chiếu acid chrysophanic, d�ng bột Đại ho�ng [mẫu chuẩn], tiến h�nh chiết như dung dịch thử.
- Bản mỏng Silicagel GF254 đ� hoạt h�a ở 1050C trong 1 giờ.
- Dung m�i khai triển: Ether dầu hỏa - ethyl acetat - acid formic [75 : 25 : 1].
- C�ch tiến h�nh: Chấm ri�ng rẽ l�n bản mỏng mỗi dung dịch tr�n. Sau khi triển khai sắc k�, quan s�t bản mỏng dưới �nh s�ng tử ngoại ở bước s�ng 366nm. Sắc k� đồ của dung dịch thử phải c� vết ph�t huỳnh quang m�u v�ng, c� c�ng gi� trị Rf với acid chrysophanic tr�n sắc k� đồ của dung dịch đối chiếu. C�c vết huỳnh quang v�ng chuyển th�nh m�u đỏ khi hơ bản mỏng trong hơi amoniac hoặc phun thuốc thử KOH 5%/EtOH. Nếu d�ng dược liệu đối chiếu, tr�n sắc k� đồ của dung dịch thử phải c� c�c vết c�ng m�u sắc v� gi� trị Rf với c�c vết tr�n sắc k� đồ của dung dịch đối chiếu.
- C�c phản ứng vi ho�
Phản ứng vi ho�:
Cắt một l�t vi phẫu mỏng, kh�ng tẩy rửa, kh�ng nhuộm. �ặt l�t cắt v�o trong hộp petri c� chứa hơi amoniac. Sau một thời gian soi l�t cắt dưới k�nh hiển vi. C�c tổ chức c� chứa c�c dẫn chất anthranoid sẽ c� m�u n�u đỏ.
Vi thăng hoa:
Trải bột dược liệu th�nh lớp mỏng trong một nắp chai bằng nh�m, đốt nhẹ tr�n đ�n cồn để loại nước. Sau đ� đậy l�n nắp nh�m một miếng lam k�nh, b�n tr�n c� miếng b�ng đ� thấm nước, tiếp tục đun n�ng trong khoảng 5 - 10 ph�t. Lấy lam k�nh ra để nguội, soi k�nh hiển vi thấy tinh thể h�nh kim m�u v�ng. Sau khi nhỏ dung dịch natri hydroxyd l�n lam k�nh, dung dịch sẽ c� m�u đỏ.
về đầu trang
2. �ịnh lượng c�c hợp chất anthranoid bằng phương ph�p đo quang
Nguy�n tắc:
D�ng acid acetic để thủy ph�n c�c dạng anthraglycosid th�nh dạng aglycon. Chiết xuất bằng dung m�i hữu cơ [ether hoặc cloroform]. Tiến h�nh phản ứng Borntraeger với dịch chiết. Đo mật độ quang của dung dịch ở bước s�ng 515nm.
C�c bước tiến h�nh:
� Chiết xuất
C�n ch�nh x�c a gam bột dược liệu [0,050g nếu l� Đại ho�ng, 0,100g nếu l� c�c dược liệu kh�c: Cốt kh� củ, Thảo quyết minh, H� thủ � đỏ �]. Cho dược liệu v�o b�nh cầu hoặc b�nh n�n dung t�ch 250ml c� lắp ống sinh h�n hồi lưu. Th�m 7,5ml acid acetic băng. Đun s�i trong 15 ph�t tr�n bếp điện c� lưới amiang. Sau khi để nguội th�m v�o b�nh [qua ống sinh h�n ngược] 30ml cloroform. Đun s�i 15 ph�t tr�n nồi c�ch thủy. L�m nguội dịch chiết. Gạn hỗn hợp cloroform - acid qua phễu c� giấy lọc v�o b�nh gạn dung t�ch 100ml [giấy lọc gấp nếp nhỏ đến mức độ tối thiểu c� thể]. Bột trong b�nh c�ng với giấy vừa lọc lại được đun hồi lưu tiếp tục với 20ml cloroform trong 10 ph�t. Gạn dịch chiết qua phễu c� giấy lọc v�o b�nh gạn tr�n. Rửa b�nh v� giấy lọc với 10ml cloroform. Gộp c�c dịch chiết cloroform.
� L�m phản ứng m�u
Cho từ từ v�o b�nh gạn c� chứa dịch chiết cloroform 15ml dung dịch NaOH 40%. Lắc nhẹ, [phản ứng tỏa nhiệt, nếu cần, l�m lạnh b�nh gạn dưới v�i nước lạnh]. Th�m v�o b�nh gạn 25ml dung dịch NaOH 5% c� chứa 2% amoniac. Lắc đều. Gạn lớp nước c� m�u đỏ v�o b�nh định mức 100ml. Tiếp tục lắc lớp cloroform với dung dịch NaOH 5% c� chứa 2% amoniac đến khi lớp nước kh�ng c�n c� m�u. Th�m dung dịch NaOH 5% c� chứa 2% amoniac v�o b�nh định mức đến đủ 100ml. R�t dung dịch ra một cốc c� mỏ dung t�ch 200ml rồi đặt l�n nồi c�ch thủy s�i trong 20 ph�t. Để nguội rồi cho lại v�o b�nh định mức. Th�m dung dịch NaOH 5% c� chứa 2% amoniac cho đủ 100ml.
� Đo mật độ quang
Đo mật độ quang ở bước s�ng 515nm, cốc đo d�y 1cm với mẫu trắng l� dung dịch NaOH 5% c� 2% NH4OH.
� Th�nh lập đường chuẩn v� phương tr�nh hồi quy tuyến t�nh
- Pha dung dịch mẫu chuẩn
Nguy�n tắc: C�n ch�nh x�c 0,0100g acid chrysophanic h�a tan ho�n to�n trong 10ml cloroform. Dung dịch n�y được l�m phản ứng m�u Borntraeger theo phương ph�p của Auterhoff.
Cho từ từ 15ml NaOH 40%, rồi 25ml dung dịch NaOH 5% c� 2% NH4OH v�o dung dịch tr�n, lắc, gạn lớp nước m�u đỏ v�o một b�nh định mức c� dung t�ch 100ml, rồi lại lắc tiếp với dung dịch NaOH 5% c� 2% NH4OH đến khi kh�ng m�u. Gạn dung dịch m�u v�o b�nh định mức tr�n, th�m dung dịch NaOH 5% c� 2% NH4OH cho đủ 100ml. Dung dịch n�y l� dung dịch mẹ [nồng độ 0,1% = 10.10-3%] d�ng pha c�c mẫu c� nồng độ kh�c nhau để đo mật độ quang học.
- Pha dung dịch đo quang
Từ dung dịch mẫu chuẩn 10.10-3% pha một thang nồng độ từ 0,5.10-3 đến 2,5.10-3%.
Lấy 5ml dung dịch 10.10-3% pha th�nh 100ml, được dung dịch c� nồng độ 0,5.10-3%. Tương tự lấy 10ml, 15ml, 20ml v� 25ml dung dịch 10.10-3% pha th�nh 100ml, được dung dịch c� nồng độ tương ứng l� 1,0.10-3%; 1,5.10-3%; 2,0.10-3% v� 2,5.10-3%.
- Đo mật độ quang học của thang dung dịch acid chrysophanic chuẩn ở bước s�ng 515nm.
Nồng độ
0,5.10-3
1,0.10-3
1,5.10-3
2,0.10-3
2,5.10-3
Độ hấp thụ A
0,125
0,232
0,353
0,465
0,578
Đường chuẩn biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang học với nồng độ.
Đường chuẩn định lượng anthranoid trong dược liệu theo acid chrysophanic
Từ mối tương quan giữa mật độ quang học với nồng độ l� tuyến t�nh, x�y dựng được phương tr�nh hồi quy tuyến t�nh y = 227,8x + 0,0098 với r2 = 0,999872 hay r2 = 1 trong đ� y l� mật độ quang học [A] v� x l� nồng độ.
T�nh kết quả
H�m lượng phần trăm dẫn chất hydroxyanthracen trong dược liệu t�nh theo acid chrysophanic, được t�nh theo c�ng thức:
A: mật độ quang học của dung dịch m�u
m: khối lượng dược liệu
h: h�m ẩm dược liệu
x: h�m lượng phần trăm dẫn chất anthraquinon trong dược liệu
Ghi ch�:
Kết quả thu được từ phương ph�p tr�n l� phản �nh lượng anthranoid to�n phần, bao gồm dạng tự do, dạng glycosid, dạng oxy ho� v� dạng khử. Nếu muốn định lượng ri�ng từng dạng th� cần ch� �:
- Nếu muốn định lượng dạng tự do, bỏ qua qu� tr�nh thuỷ ph�n với acid acetic
- Nếu muốn dịnh lượng dạng oxy ho� th� bỏ qua qu� tr�nh đun n�ng 20 ph�t trước khi so m�u.
- Kết quả dạng khử được t�nh từ mật độ quang của hiệu số 2 lần đo trước v� sau khi đun n�ng.
- Nồng độ dạng glycosid l� hiệu số giữa nồng độ phần trăm dạng anthranoid to�n phần v� dạng tự do.
-------
Mọi th�ng tin li�n quan đến trang web Xin vui l�ng li�n hệ theo số điện thoại 01234195602 hoặc theo địa chỉ Email: thannv@hup.edu.vn