Các dẫn chất coumarin có nhóm OH phenol tự do sẽ cho màu xanh với thuốc thử FeCl3 .
Dựa vào phản ứng ghép đôi với muối diazoni: cho vào ống nghiệm 1-2ml dịch coumarin trong cồn, thêm 3ml dung dịch NaCO3 2%. Đun cách thủy rồi để nguội, thêm vào dung dịch vài giọt thuốc thử diazo. Có thể dùng thuốc thử diazo của paranitroanilin hoặc của acid sulfanilic. Màu bền và màu thay đổi tùy theo cấu trúc từ vàng, cam , đỏ cam, hồng, đỏ .
Vi thăng hoa để coumarin bám trên lam kính rồi cho tác dụng với 1 giọt dung dịch I + KI, soi kính hiển vi sẽ thấy có tạo thành tinh thể iodo coumarin màu nâu sẫm hoặc tím .
Dựa vào độ tan khác nhau khi mở vòng và đóng vòng lacton: cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1-2ml dịch chiết cồn từ dược liệu. Ống thứ 1 cho thêm 0,5 ml NaOH 10% rồi đun cách thủy cả 2 ống [ống có coumarin thường có màu vàng xuất hiện]. Để nguội, thêm vào mỗi ống 4ml nước cất, nếu ống thứ 1 trong hơn ống thứ 2 nhưng sau đó acid hóa mà đục hoặc có kết tủa như ống thứ 2 thì sơ bộ xác định có coumarin.
Dựa vào huỳnh quang tăng lên ở môi trường kiềm khi soi dưới ánh đèn tử ngoại. Nguyên nhân sau khi mở vòng lacton bằng kiềm thì coumarin tạo thành dẫn chất hydroxycinnamic ở dạng cis [acid coumarinic]. Chất này dưới tác dụng của tia tử ngoại thì chuyển thành dạng trans [acid coumaric ] có huỳnh quang sáng hơn.
Cách làm: nhỏ một giọt dung dịch có coumarin lên giấy thấm, nhỏ tiếp lên đó 1 giọt NaOH 5%, sấy nhẹ. Che ½ vết với đồng xu rồi chiếu tia tử ngoại trong vài phút sau đó cất đồng xu đi, sẽ thấy nửa hình tròn không che thì sáng hơn nửa vòng tròn bị che. Nếu tiếp tục chiếu thì độ sáng của ½ bị che sẽ sáng dần lên.
Chuyển coumarin thành dẫn chất hydroxamic bằng cách cho tác dụng với hydroxylamin và kiềm, sau đó cho tác dụng tiếp với muối sắt III, sẽ tạo phức có màu.
Cách làm: cho vài giọt dung dịch coumarin trong ether vào ống nghiệm, thêm 1 giọt dung dịch bão hòa hydroxylamin hydrochlorid trong cồn và một giọt KOH bão hòa trong cồn. Hỗn hợp được đun trên ngọn lửa nhỏ cho đến khi phản ứng bắt đầu, sẽ thấy có bọt nhỏ. Sau khi nguội, acid hóa hỗn hợp với HCl 0,5N rồi thêm 1 giọt FeCl3 1%, sẽ có màu tím đỏ .
Để xác định các coumarin, thuận tiện nhất là tiến hành S.K.L.M.
· Dịch chiết để chấm sắc ký: dịch chiết methanol
· Chất hấp phụ: L.M1 = Silicagel G.
L.M2 = Silicagel G trộn với 3 phần formamid-nước [1:2].Các bản kính đã tráng được làm khô 18 giờ ở nhiệt độ thường .
· Dung môi khai triển :
D.M1 = Toluen-ethylformat-formic acid [50:40:10]
D.M2 = Benzen- aceton [9:1]
D.M3 = Benzen -ethylacetat [9:1]
· Hiện màu bằng cách phun dung dịch iod kali iodid [ 0,2g iod và 0,4g KI trong 100ml nước ] hoặc soi dưới ánh đèn tử ngoại [365 nm]
Bảng phân tích S.K.L.M các coumarin [theo M. Luckner]
* Huỳnh quang sau khi phun dung dịch KOH trong ethanol
Những thuốc thử khác cũng đã được sử dụng để phát hiện coumarin trong sắc ký như KOH trong methanol, thuốc thử diazo, thuốc thử chlorosulphonic acid.
Phổ tử ngoại của coumarin nhóm 1 thường có một băng rộng hấp thụ trong vùng 320-340 nm với log e trong khoảng 4,0. Băng hấp thu này gây ra là do hiệu ứng liên hiệp của nhóm carbonyl vòng lacton với nhân benzen và một băng hấp thu hẹp trong vùng 250-260 nm có cường độ hấp thu thấp hơn một chút. Sau đây là một số ví dụ :
227 [4,2] 251s[3,7] 298[3,8] 338[4,1]
243 [3,3] 253[3,3] 323[4,1]
220s[4,1] 250[3,8] 260[3,8] 330[4,2]
250s[3,6] 260[3,69] 330[4,19]
229 [4,2] 254[3,7] 299[ 3,7] 346[4,1]
237s [3,5] 253s[3,3] 300s[4,0] 319[4,1]
Phổ tử ngoại của các furanocoumarin thường xuất hiện 1 băng rộng có hấp thu trong vùng 300 -310 nm, một băng hẹp trong vùng 250-270, còn có thể có 1 băng hẹp nữa ở vùng 220. Cường độ hấp thu các đỉnh cao dần về phía sóng ngắn. Sau đây là một số ví dụ:
Pimpenellin 257 [4,3] 305 [4,0] 365s[3,1]
Angelicin 253 [4,3] 300 [3,9] 330[3,6]
Psoralen 245 [4,3] 250 [4,3] 290[4,0]
Dựa vào phương pháp oxy hóa bằng KMnO4 0,1N sau khi cất kéo bằng hơi nước ở áp suất giảm .
Ưng dụng phương pháp đo màu sau khi làm các phản ứng màu ,ví dụ phản ứng kết hợp với các muối diazoni.
Dựa vào phổ U.V hoặc phổ huỳnh quang [sau khi tách các vết bằng S.K.L.M]
Dựa vào sắc ký lỏng cao áp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Ngô Văn Thu [2011], Bài giảng dược liệu, tập I. Trường đại học Dược Hà Nội
Phạm Thanh Kỳ [1998], Bài giảng dược liệu, tập II. Trường đại học Dược Hà Nội
Đỗ Tất Lợi [2004], Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học
Viện dược liệu [2004], Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập I, Nhà xuất bản khoa hoc kỹ thuật.
Viện Dược liệu [2004], Cây thuốc và động vật làm thuốc Việt Nam, tập II, Nhà xuất bản Khoa học kỹ thuật