Nhuộm kép là gì

Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm. Gram dương [Gram positive] và Gram âm [Gram negative] dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram [1853 -1938]. Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884, về sau được Hucker và nhiều người khác cải tiến.

NỘI DUNG KỸ THUẬT NHUỘM GRAM VI KHUẨN

Nguyên lý của kỹ thuật nhuộm Gram
Vi khuẩn bắt màu Gram âm hay Gram dương do sự khác nhau về thành phần, cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn.
Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dầy, nhiều acid teichoic, chúng không bị ảnh hưởng bởi sự tẩy màu bằng cồn, vẫn giữ nguyên được màu tím ban đầu nếu vách tế bào không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như tuổi, tác dụng của kháng sinh...
Vi khuẩn Gram âm có một lớp peptidoglycan gắn với lớp phospholipid kép, xen kẽ các protein ở màng ngoài, lớp màng này dễ bị phá hủy bởi cồn khi tẩy màu, do đó phức hợp tinh thể tím gentian - iod không bền, bị tẩy màu và màu được thay bởi các thuốc nhuộm khác.

Dụng cụ, thiết bị
- Tủ an toàn sinh học [ATSH] cấp 2
- Kính hiển vi quang học.
- Máy ly tâm
- Máy trộn, lắc
- Ống vô trùng có nắp đậy.
- Đèn cồn, que cấy, lam kính, lá kính mỏng, bút viết kính, dầu soi kính, giấy thấm dầu.
- Pipet Pasteur vô trùng. 

Vật liệu, hoá chất

[1] Các loài vi khuẩn hoặc các hỗn dịch các vi khuẩn này. Vi khuẩn Gram âm: E.coli, Salmonella,..; Gram dương: S. aureus, Bacillus cereus; dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn.
[2] Dung dịch tím gentians
[3] Dung dịch Lugol
[4] Dung dịch alcohol 90%
[5] Dung dịch fucshin kiềm

Các bước tiến hành kỹ thuật nhuộm Gram

Bước một, dàn tiêu bản và cố định tiêu bản:
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng [hoặc dịch cơ thể, mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn]. Hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính, để khô trong phòng thí nghiệm.
Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính. Việc cố định nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống.

Bước hai, nhuộm màu:

– Thứ nhất, nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước;
– Thứ hai, nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước;
– Thứ ba, khử màu: nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây [cho đến khi vừa thấy mất màu], rửa nước;
– Thứ tư, nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô.
* Kết quả: quan sát ở vật kính dầu 100x. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng.

Giải thích tính bắt màu Gram của vi khuẩn

Vi khuẩn Gram dương có vách tế bào dày từ 15 đến 50 nm, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan. Chất này có khả năng giữ phức hợp tím gentians – iod. Trong khi đó, lớp vách tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharde [LPS] bên ngoài.

Sau khi nhuộm với phức hợp gentians – iod, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong vách tế bào Gram dương. Từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến vách tế bào bắt giữ phức hợp gentians – iod bên trong tế bào.
Đối với vi khuẩn Gram âm, dung dịch alcohol 90% đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của vách tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng [chỉ khoảng 10 nm] không thể giữ lại phức hợp gentians – iod và tế bào Gram âm bị khử màu và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung.

 Những sai lầm có thể gặp trong phương pháp nhuộm Gram

– Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram dương nhuộm thành màu hồng của vi khuẩn Gram âm, đó là:

+ Phết vi khuẩn ở lứa cấy qúa già [trên 24h], cấu trúc vách vi khuẩn gram dương không còn bền chặt như ở lứa cấy trẻ, do vậy mất khả năng ngăn cản sự tẩy màu của alcohol.

+ Dung dịch lugol không còn tốt, do đã pha quá lâu và mất đi iod. Trường hợp này có thể nhận biết khi dung dịch lugol không còn sậm màu.

+ Tẩy màu bằng alcohol quá lâu đã làm cho vi khuẩn Gram dương cũng bị tẩy màu.
– Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram âm nhuộm thành màu tím của vi khuẩn Gram dương, đó là:

+ Phết vi khuẩn quá dầy làm cho alcohol không thể tẩy màu toàn bộ vi khuẩn trong phết nhuộm.

+ Tẩy màu bằng alcohol quá ngắn hay dung dịch alcohol bị pha quá loãng làm cho màu Gram không được tẩy khỏi tế bào vi khuẩn.

HIỆN NAY MELAB DIAGNOSTICS CUNG CẤP BỘ NHUỘM GRAM “MELAB GRAM COLOR SET” GỒM ĐẦY ĐỦ CÁC HÓA CHẤT CẦN THIẾT CHO VIỆC TIẾN HÀNH NHUỘM GRAM VỚI CÁC MẪU BỆNH PHẨM, THỰC PHẨM,...

Tìm hiểu thêm về sản phẩm tại đây: MELAB GRAM COLOR SET

Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương 50 BÀI 4 : CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VÀ QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT I. Phương pháp làm tiêu bản tạm thời : 1.1. Cách làm tiêu bản giọt ép - Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi. - Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí. Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống. - Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi. 1.2. Cách làm tiêu bản giọt treo Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích - Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa. - Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính. - Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính. - Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên phần lõm của phiến kính. 1.3. Cách làm tiêu bản tạm thời có nhuộm màu a. Nguyên tắc : Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm màu. b. Cách nhuộm : + Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh mêtylen 0,001% lên phiến kính. + Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm. + Đậy lá kính lên giọt dịch. + Quan sát tiêu bản ở vật kính [x 10] rồi [x 40] Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương 51 II. Phương pháp làm tiêu bản cố định : 2.1. Các bước tiến hành làm tiêu bản cố định 1. Làm vết bôi : 2. Cố định vết bôi : Các cách cố định : + Cố định bằng nhiệt : + Cố định bằng hoá chất :  Cách này tuy phức tạp nhưng không gây biến dạng tế bào, không gây biến đổi cấu trúc tế bào và không làm đứt các tiên mao.  Người ta thường dùng các hoá chất là rượu và axêtôn để cố định vết bôi.  Cách cố định : Có thể thực hiện một trong những cách sau : o Nhúng vết bôi vào rượu. Với rượu 950 ngâm vết bôi từ 5 - 15 phút. Với rượu mêtylíc ngâm khoảng 2 - 5 phút. o Ngâm vết bôi vào dung dịch axêtôn trong 5 phút. o Nhỏ vài giọt rượu 90 - 950 lên vết bôi. Đốt cháy và dập tắt ngay. Làm như vậy vài lần rồi để khô. 2.3. Nhuộm màu tiêu bản cố định a. Nguyên tắc : - Sử dụng thuốc nhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành phần khác nhau của tế bào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững. - Tuỳ theo mục đích nghiên cứu và khả năng bắt màu khác nhau của các thành phần tế bào mà chọn loại thuốc nhuộm và cách nhuộm cho phù hợp. - Có 2 cách nhuộm chính : + Nhuộm đơn : Chỉ dùng 1 loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản. + Nhuộm kép : Dùng đồng thời 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản. b. Cách nhuộm : - Đặt tiêu bản lên cầu thuỷ tinh [đặt nằm ngang miệng một khay nhân, hoặc thuỷ tinh]. - Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin Ziehl, để yên từ 1 - 2 phút. Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương 52 - Rửa vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹ qua vết bôi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa - Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn - Quan sát tiêu bản ở vật kính [x 40] rồi chuyển sang vật kính [x 100] dùng dầu soi. III. Quan sát đặc điểm sinh học của các nhóm vi sinh vật : 3.1. Quan sát đặc điểm sinh học của vi khuẩn [Bacteria]. Người ta thường làm tiêu bản giọt ép và giọt treo để quan sát hình thái vi khuẩn sau khi nuôi cấy chúng ở nhiệt độ 370C sau 24 - 48h 3.2. Quan sát đặc điểm sinh học của xạ khuẩn [Actinomycetes] Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát - Hình dạng bào tử - Đặc điểm cuống sinh bào tử. - Phương thức hình thành chuỗi bào tử Cách quan sát - Làm tiêu bản giọt ép với Streptomyces griseus cấy trên thạch nghiêng. 3.3. Quan sát đặc điểm sinh học của nấm mốc [Molds] Các đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát: - Đặc điểm của sợi nấm: Màu sắc, có vách ngăn hay không có vách ngăn. - Đặc điểm của cơ quan sinh sản: hình dạng, cách sắp xếp các bộ phận của cơ quan sinh sản. - Hình dạng, cấu tạo, cách sắp xếp của bào tử. Cách quan sát: - Làm tiêu bản nấm mốc không nhuộm màu - Vẽ hình và nhận xét về hình dạng chung của sợi nấm; vị trí, hình dạng, cách sắp xếp của bào tử, thể bình, cuống thể bình, cuống bào tử đính của 2 giống nấm mốc trên. - Thao tác sử dụng kính hiển vi soi nổi - Làm tiêu bản nấm mốc nhuộm màu: 3.4. Quan sát đặc điểm sinh học của nấm men [Yeasts] Những đặc điểm sinh học đặc trưng cần quan sát. - Hình thái, kích thước tế bào nấm men. - Sự nảy chồi của nấm men Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương 53 - Hình dạng, số lượng bào tử trong 1 túi bào tử. Cách quan sát: - Làm tiêu bản nhuộm đơn nấm men cấy trong môi trường dịch thể với xanh mêtylen Loeffler. - Quan sát sự nảy chồi của nấm men. IV. PHƯƠNG PHÁP NHUỘM KÉP - QUAN SÁT CẤU TẠO TẾ BÀO VI SINH VẬT 4.1 Các phương pháp nhuộm kép - Quan sát cấu tạo tế bào sinh vật: - Nhuộm kép là phương pháp nhuộm trong đó người ta sử dụng 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản. - Nguyên tắc của việc nhuộm kép + Các cấu trúc khác nhau, thậm chí các phần khác nhau của một cấu trúc thường có tính chất lý học, hoá học cũng như khả năng bắt màu khác nhau. + Việc sử dụng đồng thời các loại thuốc nhuộm trên cùng một tiêu bản cho phép ta có thể quan sát và phân biệt các cấu trúc dễ dàng hơn. 1.Phương pháp nhuộm Gram : a. Nguyên tắc : - Dựa trên khả năng bắt màu của tế bào chất và màng tế bào với thuốc nhuộm tím kết tinh và iôt mà hình thành nên hai loại phức chất khác nhau. + Loại phức chất thứ nhất vẫn giữ nguyên màu của thuốc nhuộm nên không bị rửa trôi khi xử lý bằng cồn. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram dương. + Loại phức chất thứ hai không còn giữ được màu của thuốc nhuộm nên mất màu khi xử lý bằng cồn và bắt màu của thuốc nhuộm bổ sung. Vi sinh vật có phức chất này thuộc loại gram âm. b. Cách tiến hành : - Làm tiêu bản : + Dùng que cấy lấy nước vô trùng để làm 3 vết bôi trên phiến kính [hai đầu và giữa phiến kính]. + Dùng que cấy lấy một chút khuẩn lạc của chúng làm vết bôi theo thứ tự sau:  Bên trái phiến kính là Bacillus subtilis  Bên phải phiến kính là Escherichia coli Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương 54  Ở giữa phiến kính là Bac.subtilis trộn lẫn với E. coli + Để khô vết bôi trong không khí hoặc cố định nhẹ trên ngọn đèn cồn. - Nhuộm tiêu bản + Đặt 3 miếng giấy lọc lên 3 vết bôi. + Nhuộm tiêu bản bằng thuốc nhuộm tím kết tinh qua giấy lọc trong 1 phút [hình 50] + Nhuộm lugol trong 1 phút. + Rửa nước. + Tẩy bằng cồn trong 30 giây, để nghiêng tiêu bản nhỏ từ từ từng giọt cồn cho đến khi tan hết màu. + Rửa nước. + Nhuộm bổ sung Fuchsin hay Safranin từ 10 - 30 giây + Làm khô và soi tiêu bản với vật kính dầu. - Kết quả: + Vết bôi của Bac. sublitis màu tím - gram dương. + Vết bôi của Bac. sublitis + E.Coli có màu hồng lẫn màu tím. + Vết bôi của E.Coli màu hồng - gram âm. 4.2. Phương pháp nhuộm bào tử của tế bào vi khuẩn - Sự hình thành bào tử là một hình thức đổi mới tế bào khi gặp những điều kiện không thuận lợi trong chu trình sống - Nguyên tắc nhuộm : Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử : dày, chắc, khó bắt màu, chứa nhiều lipit. Trước hết xử lý để tế bào chất bào tử dễ bắt màu bằng nhiệt và axit. Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính mạnh. Tẩy màu tế bào chất tế bào đi và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất tế bào bắt màu phân biệt. Phương pháp Ôgietska : - Làm vết bôi với Bac. subtilis đã nuôi cấy 2 tuần tuổi trên ống thạch nghiêng và để vết bôi khô tự nhiên. - Nhỏ vài giọt HCl 0,5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn đèn cồn cho bốc hơi, giữ 2 phút rồi rửa nước. - Đặt lên vết bôi miếng giấy lọc rồi nhỏ Fuchsin Ziehl, hơ nóng cho đến khi bốc hơi. Nếu thuốc nhuộm cạn phải bổ sung ngay và giữ trong 5 phút. Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương 55 - Bỏ giấy ra và rửa lại vết bôi bằng nước. - Tẩy màu bằng cách nhúng phiến kính vào dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút. - Rửa vết bôi bằng nước. - Nhuộm vết bôi bằng xanh mêtylen Loeffler trong 5 - 15 phút. - Rửa nước, để khô tự nhiên vết bôi. - Quan sát tiêu bản trên kính hiển vi với vật kính đầu. - Kết quả : Bào tử màu đỏ, tế bào chất màu xanh. 4.3. Phương pháp nhuộm nhân [chất nhân] của vi sinh vật Ở các vi sinh vật bậc thấp, nhân chưa có cấu tạo điển hình [chất nhân chưa được bao bọc bởi màng nhân]. Ở các vi sinh vật bậc cao, nhân có cấu tạo điển hình [có màng nhân bao xung quanh chất nhân]. Thành phần hoá học của cá nhân và chất nhân đều là ADN, chỉ ở một số rất ít loài vi sinh vật là ARN. - Nguyên tắc : Do tính chất bắt màu của ADN trong nhân và ARN trong tế bào chất tương tự nhau. Dùng HCl để làm tan ARN trong tế bào chất rồi mới tiến hành nhuộm màu ADN trong nhân. - Cách tiến hành : + Làm tiêu bản từ ống thạch nghiêng cấy vi khuẩn sau 24h hoặc cấy nấm men sau 48h. + Để khô tự nhiên rồi cố định tiêu bảnbằng hơi dung dịch axit osmic 2% trong 2 - 3 phút [có thể thay axit này bằng axit axêtic]. + Đặt tiêu bản vào cốc thủy tinh có HCl 1N, đun cốc axit này ở 600C và giữ trong 3 - 5 phút. + Rửa ngay tiêu bản bằng nước cất. + Nhỏ lên tiêu bản dung dịch Formalin 1%, giữ trong 1 - 2 phút. + Rửa lại tiêu bản bằng nước cất. + Nhuộm vết bôi bằng dung dịch 0,5 - 1% Fuchsin và giữ trong 1 - 2 phút. + Rửa thật sạch lớp thuốc nhuộm trên tiêu bản bằng nước cất. Thí nghiệm vi sinh vật học ThS.Lê Xuân Phương 56 + Để khô, quan sát tiêu bản với vật kính dầu trên kính hiển vi. * Kết quả : - Nhân màu nâu đỏ thẫm, tế bào chất màu hồng.