Định lượng DNA bằng phương pháp đo mật đo quang

Trong sinh học phân tử, việc định lượng các axit nucleic thường được thực hiện để xác định nồng độ trung bình DNA hoặc RNA trong hỗn hợp, cũng như độ tinh khiết của chúng. Các phản ứng sử dụng axit nucleic thường đòi hỏi một lượng và độ tinh khiết đặc biệt để có hiệu suất tối ưu. Cho đến nay, có hai cách tiếp cận chính được sử dụng bởi các nhà khoa học để định lượng, hoặc thiết lập nồng độ của axit nucleic [như DNA hoặc RNA] trong dung dịch. Đây là các phép đo lượng tử quang phổ và sự gắn kết huỳnh quang tia cực tím với sự hiện diện của một chất nhuộm DNA

Phân tích quang phổ dựa trên các nguyên tắc mà axit nucleic hấp thụ ánh sáng cực tím theo một mẫu cụ thể. Trong trường hợp DNA và RNA, một mẫu được tiếp xúc với ánh sáng cực tím ở bước sóng 260 nanô mét [nm] và một máy dò ảnh đo ánh sáng đi qua mẫu. Một số ánh sáng cực tím sẽ đi qua và một số sẽ được hấp thụ bởi DNA / RNA. Ánh sáng càng hấp thụ bởi mẫu, nồng độ axit nucleic càng cao trong mẫu. Hiệu ứng kết quả là ít ánh sáng hơn sẽ tấn công photodetector và điều này sẽ tạo ra mật độ quang học cao hơn [OD]

Sử dụng Luật Beer-Lambert có thể liên quan đến lượng ánh sáng hấp thụ đến nồng độ của phân tử hấp thụ. Ở bước sóng 260 nm, hệ số tuyệt chủng trung bình của DNA sợi đôi là 0,020 [μg / ml] -1 cm-1, đối với DNA đơn sợi, 0,027 [μg / ml] -1 cm-1, đối với đơn RNA có vân là 0,025 [μg / ml] -1 cm-1 và đối với oligonucleotides sợi đơn đơn ngắn phụ thuộc vào độ dài và thành phần cơ bản. Do đó, Absorbance [A] là 1 tương ứng với nồng độ 50 μg / ml đối với DNA kép. Phương pháp tính này có giá trị cho đến A ít nhất là 2.Cần có một hệ số tuyệt chủng chính xác hơn cho các oligonucleotide; những điều này có thể được dự đoán bằng cách sử dụng mô hình hàng xóm gần nhất.

Tính toán 
Mật độ quang phổ  được tạo ra từ phương trình:

Mật độ quang học = Log [cường độ ánh sáng / cường độ ánh sáng
Ánh sáng truyền qua]
Về mặt thực tế, một mẫu không chứa DNA hoặc RNA không nên
hấp thụ bất kỳ ánh sáng cực tím nào và do đó tạo ra OD = 0

Mật độ quang học = Nhật ký [100/100] = 0

Khi sử dụng phân tích quang phổ để xác định nồng độ DNA hoặc RNA, luật Beer-Lambert được sử dụng để xác định nồng độ không biết mà không cần các đường cong tiêu chuẩn. Về cơ bản, Luật Beer Lambert làm cho nó có thể liên quan đến lượng ánh sáng hấp thụ vào nồng độ của phân tử hấp thụ. Các đơn vị hấp thụ sau cho các yếu tố chuyển đổi nồng độ axit nucleic được sử dụng để chuyển đổi OD thành nồng độ của các mẫu axit nucleic chưa biết:

A260 dsDNA = 50 μg / ml
A260 ssDNA = 33 μg / ml
A260 ssRNA = 40 μg / ml
Các nhân tố chuyển đổi 
Khi sử dụng chiều dài đường dẫn 10 mm, chỉ cần nhân OD bằng hệ số chuyển đổi để xác định nồng độ. Ví dụ, mẫu dsDNA OD ODD 2.0 tương ứng với mẫu có nồng độ 100 ug / ml.

Khi sử dụng chiều dài đường dẫn ngắn hơn 10mm, OD kết quả sẽ được giảm bởi một yếu tố 10 / chiều dài đường dẫn. Sử dụng ví dụ trên với chiều dài đường dẫn 3 mm, OD đối với mẫu 100 ug / ml sẽ giảm xuống còn 0,6. Để bình thường hóa nồng độ tương đương 10mm, sau đây được thực hiện:

0,6 OD X [10/3] * 50 ug / ml = 100 ug / ml

Hầu hết các chất quang phổ cho phép lựa chọn loại axit nucleic và chiều dài đường dẫn để nồng độ kết quả được bình thường hóa với chiều dài đường dẫn 10 mm dựa trên các nguyên tắc của luật Bia.

Tư vấn trực tuyến - 0919.278.276

Ms. Trinh - 0919.278.276

Ms.Trinh - 091.868.2088

• Đang online 44
• Hôm nay 1660
• Hôm qua 3610
• Trong tuần 106295
• Trong tháng 400577
• Tổng cộng 5127432

Phương pháp ly trích và kiểm tra chất lượng DNA

Dùng dao y tế bâm nhuyễn khoảng 50–100 mg mẫu cho vào tube 2ml chứa sẳn các hóa chất bao gồm 700ml buffer lysis và 18ml proteinase K, ủ hỗn hợp ở 37oC trong 12–24 giờ.

Tiến hành li trích

• Thêm 300ml phenol:chloroform: isoamy alcolhol [25:24:1] vào tube chứa mẫu sau đó lắc đều và ly tâm 10.000 vòng trong 5 phút ở 25oC
• Hút dịch lỏng phía trên cho qua tube mới. Sau đó thêm vào tube 700ml chloroform:chloroform [1:1], lắc đều, li tâm 10.000 vòng trong 5 phút ở 25oC.
• Hút dịch lỏng phía trên cho qua tube mới. Sau đó thêm vào tube 700ml chloroform, lắc đều, li tâm 10.000 vòng 5 phút ở 25oC.
• Tiếp tục hút phần dịch lỏng phía trên cho qua tube mới. Cho thêm 300ml NaCl 1.2M, 150ml NaOAC2M, 1000ml ethanol 100%,lắc đều, ly tâm 10.000 vòng trong 5 phút ở 25oC.
• Bỏ phần dịch lỏng bên trên, thu lấy kết tủa, cho thêm 1000ml ethanol 70%  rồi lắc nhẹ, ly tâm 10.000 vòng trong 5 phút ở 25oC.
• Bỏ phần dịch lỏng, thu lấy kết tủa, để khô DNA ở nhiệt độ phòng, sau đó thêm 200ml TE 1 lần và được trữ ở -20oC.

2. Kiểm tra chất lượng DNA

Có thể kiểm tra chất lượng DNA [định lượng DNA ] bằng phương pháp quang phổ hoặc bằng phương pháp điện di

2.1 Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp quang phổ [UV]

Máy đo quang phổ

Quang phổ UV có thể sử dụng như 1 kỹ thuật định lượng để đo nồng độ của DNA và mức độ nhiễm của protein. DNA hấp thụ mạnh ở bước sóng 260 nm và kém ở 280 nm trong khi protein thì ngược lại.

DNA được đánh giá là sạch khi có tỷ số 260/280 nằm trong khoảng  1,7-2,0. Việc nhiễm protein sẽ làm tỷ số 260/280 thấp hơn 1,7 ngoài ra sự hiện diện của các chất hữu cơ như phenol, chloroform có thể ảnh hưởng đến nồng độ và độ tinh sạch của DNA.

Nồng độ DNA [ ng/µl ]: 50 x HSPL x OD260 

Trong đó:

HSPL: hệ số pha loãng
OD260: chỉ số được đo ở bước sóng 260nm

2.2 Kiểm tra chất lượng DNA bằng phương pháp điện di

Phương pháp ly trích và kiểm tra chất lượng DNA [1]

• Phương pháp điện di có thể kiểm tra chất lượng DNA, sản phẩm PCR và sản phẩm cắt enzyme.
• Tùy vào sản phẩm cần kiểm tra để sử dụng nồng độ gel agarose. Thời gian và hiệu điện thế trong quá trình điện di cho phù hợp.

Nguyên tắc: 

• Khi có điện trường chạy xuyên qua gel, DNA mang điện tích âm ở pH trung tính sẽ chạy về hướng anode.
• Tốc độ di chuyển của các đoạn DNA tỉ lệ thuận với điện thế.

Dung dịch đệm: 

• Dung dịch đệm điện di ảnh hưởng đến tính di chuyển của DNA trong gel.
• Trong phòng thí nghiệm các dung dịch đệm điện di thường được sử dụng là TAE, TBE, TPE.