Resazurin là gì

VÀ PHƯƠNG PHÁP KIỂMNGHIỆM VI SINH VẬTTRONG NHÀ MÁY SỮA1GVHD : LÊ LÝ THÙY TRÂMSVTH : NGUYỄN ĐOÀN THANH DUNGNGUYỄN THỊ DIỆU HƯƠNGVĂN THỊ THU NGUYỆTTRẦN THỊ NHI2I. GIỚI THIỆU VỀ SỮA :1.Sữa là gì?Sữa là một chất lỏng màu trắng đục được tạo ra bởi con cáicủa động vật có vú, là nguồn dinh dưỡng ban đầu cho connon mới sinh.32.Chất dinh dưỡng có trong sữa :4Thành phần dinh dưỡng trong 100ml sữa mẹ và sữa bò53.Phân loại sữa:6II.HỆ VI SINH VẬT TRONG SỮA1. Nguồn gốc2.Hệ vi sinh vật trong sữaĐược chia thành 2 nhóm chính: Procaryote vàEucaryote7ProcaryoteEucaryote      Nhân chưa hoàn chỉnh        Nhân hoàn chỉnhVùng nhân chỉ là mạch ADN xoắn kép nằm trong tế bào chất, lưu giữ các thông tin di truyền cho tế bàoNằm trong tế bào chất, nhân được bao bọc bởi màn nhân, bên trong là các nhiễm sắc thể lưu giữ thông tin di truyềnĐại diện : vi khuẩnĐại diện : nấm men và nấm sợi­Các vi khuẩn thường gặp :   + Vi khuẩn lactic   + Coliform   + Vi khuẩn sinh acid butyric   + Vi khuẩn sinh acid propionic                            .  + Các vi khuẩn gây thối83.Vi sinh vật chỉ thị9III/ CÁC CHỈ TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁPKIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT TRONG NHÀMÁY SỮA:10111. Chất chỉ thị xanh Metylena)  Nguyên tắc:Các vi sinh vật ô nhiễm sữa khi phát triển là thay đổi hiệuthế oxi hóa khử, nếu cho chất chỉ thị xanh metylen vào sữasẽ làm thay đổi màu xanh metylen, tùy theo màu thay đổivà thời gian thay đổi màu có thể tính được mức độ nhiễmvi sinh vật của sữa.b)  Cách tiến hành:12Ống nghiệm: 10 ml mẫu sữa + 1 ml xanh metylen 0.5%Đậy nắp ống nghiệm, trộn đềuĐể ống nghiệm vào tủ ấm 37 ± 10oCNhiệt độ trong ống sữa đạt 38­40oC bắt đầu tính thời gianThời gian mất màu xanh methylen = giờ kết thúc – giờ bắt đầuKhi màu xanh của ống nghiệm chuyển sang màu trắng, còn lại khoảng 1cm chiều cao có màu xanh nhạt => đọc giờ kết thúc13c)  Kết quả:Thời gian mất màuMức độ nhiễm vsv< 15 phútnhiễm rất nhiều vsv15p – 1 giờô nhiễm nặng1 – 3 giờô nhiễm nhẹ> 3 giờđạt chuẩn vsv142. Chất chỉ thị Resazurin:a)  Nguyên tắc:-Sựthay đổi màu của chất chỉ thị này theo thời gian phụthuộc vào sự hoạt động của vsv hiện diện trong sữa­Điềuđó có nghĩa là phản ứng với resazurin cho ta biếtmức độ hoạt động của vsv hơn là số lượng của chúng.b)  Cách tiến hành:15Ống nghiệm: 10 ml mẫu sữa + 1 ml resazurinĐặt vào nồi cách thủy 37 ­ 38oCSau khi đạt nhiệt độ trên, bắt đầu tính giờXem xét sự thay đổi màu16c)  Kết quả: Thời gian mấtmàu=< 20 phútSự thay đổi màu Chất lượng sữaTrắngRất nhiều vsvSau 1 giờHồngÔ nhiễm nặngSau 1 giờXanh-tímÔ nhiễm nhẹSau 1 giờXanh( không đổimàu)Đạt chuẩn vsv173. Xác định tổng lượng vi sinh vật hiếu khí:a)  Nguyên tắc: Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu vàomôi trường dinh dưỡng. Đếm số khuẩn lạc mọc lên trên cơsở xem một khuẩn lạc là một sinh khối phát triển từ một tếbào hiện diện trong mẫu.b)  Cách tiến hành:18Đồng nhất và pha loãng mẫu để có độpha loãng 10­1,10­2,10-3,10-4…Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp,chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vôtrùng (mỗi nồng độ cấy2 đĩa)Rót vào mỗi đĩa petri 10-15ml môi trường PCA đã được làm nguội đến45°C, lắc cho mẫu phân tán đều vào môi trường, ủ ở 30°C trong 72 giờChọn các đĩa có số khuẩn lạc trongkhoảng 25-250 khuẩn lạc/đĩa để đếmTính tổng số vsv hiếu khí19Công thức:Trong đó: -A: số tế bào VK trong 1g hay 1ml mẫu -N: số khuẩn lạc đếm được rên các đĩa đã chọn -n: số đĩa cấy tại độ pha loãng thứ nhất -V: thể tích mẫu (ml) cấy vào đĩa -f: độ pha loãng tương ứng20c) Kết quả:Số khuẩn lạcChất lượng sữa105 tế bào/g(ml)sữa bị chua106-107 tế bào/g(ml)sữa có mùi hôi108 tế bào/g(ml)có mùi hôi không chấpnhận được109-1010 tế bào/g(ml)sữa thay đổi cấu trúc214. Xác định sự lên men:a)  Nguyên tắc:Dựa vào sự thay đổi màu sắc, sinh hơi của môi trường PRBvà mẫu trong ống Durhamb) Cách tiến hành:22Chuẩn bị thử, pha loãng mẫu 10­1. Tiến hành với mẫu 100 và 10­1Dùng pipet vô trùng lấy 0.1 mlmẫu dung dịch thứ cho vào ốngnghiệm chứa môi trường PRB tiệttrùng, lắc đều.Cho vào tủ ấm 32±1°C ủ trong 24đến 48±3 giờ.Xem kết quả23c) Kết quả: Dương Màu môi trường chuyển từ đỏ sangtínhvàng và sinh hơi trong ốngDurham.Âm tínhMôi trường màu đỏ, có thể chuyểnsang màu vàng nhưng không sinhhơi trong ống Durham.245. Xác định Staphylococcus aureus:a)  Nguyên tắc:Staphylococcus aureus được xác định cơ sở các đặc điểmtăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòngthuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập.b) Cách tiến hành:25

Resazurin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one 10-oxide) is a phenoxazine dye that is weakly fluorescent, nontoxic, cell-permeable, and redox‐sensitive.[2][3] Resazurin has a blue to purple color (at pH > 6.5) and is used in microbiological, cellular, and enzymatic assays because it can be irreversibly reduced to the pink-colored and highly fluorescent resorufin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one). At circum-neutral pH, resorufin can be detected by visual observation of its pink color or by fluorimetry, with an excitation maximum at 530-570 nm and an emission maximum at 580-590 nm.[4]

Resazurin là gì
Resazurin Names IUPAC name

7-hydroxy-10-oxidophenoxazin-10-ium-3-one

Other names

Alamar Blue, Vybrant, UptiBlue, diazo-resorcinol, azoresorcin, resazoin, resazurine

Identifiers

CAS Number

  • 550-82-3 
    Resazurin là gì
    Y
  • 62758-13-8 (sodium salt) 
    Resazurin là gì
    N

3D model (JSmol)

  • [1]: Interactive image

ChEMBL

  • ChEMBL1616414 
    Resazurin là gì
    N

ChemSpider

  • 10606 
    Resazurin là gì
    N

ECHA InfoCard 100.008.171
Resazurin là gì

PubChem CID

  • 11077

UNII

  • 1FN9YD6968 
    Resazurin là gì
    Y

CompTox Dashboard (EPA)

  • DTXSID4060280
    Resazurin là gì

InChI

  • InChI=1S/C12H7NO4/c14-7-1-3-9-11(5-7)17-12-6-8(15)2-4-10(12)13(9)16/h1-6,14H 

    Resazurin là gì
    N

    Key: PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 

    Resazurin là gì
    N

  • InChI=1/C12H7NO4/c14-7-1-3-9-11(5-7)17-12-6-8(15)2-4-10(12)13(9)16/h1-6,14H

    Key: PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYAB

SMILES

  • [1]: C1=CC2=C(C=C1O)OC3=CC(=O)C=CC3=[N+]2[O-]

Properties

Chemical formula

C12H7NO4Molar mass 229.191 g·mol−1

Solubility in water

soluble Hazards GHS labelling:

Pictograms

Resazurin là gì

Signal word

Warning

Hazard statements

H315, H319, H335

Precautionary statements

P261, P305+P351+P338 NFPA 704 (fire diamond)

Resazurin là gì

2

1

0

Except where otherwise noted, data are given for materials in their standard state (at 25 °C [77 °F], 100 kPa).

Resazurin là gì
N verify (what is 
Resazurin là gì
Y
Resazurin là gì
N ?)

Infobox references

When a solution containing resorufin is submitted to reducing conditions (Eh < -110 mV), almost all resorufin is reversibly reduced to the translucid non-fluorescent dihydroresorufin (sin. hydroresorufin) and the solution becomes translucid (the redox potential of the resorufin/dihydroresorufin pair is -51 mV vs. standard hydrogen electrode at pH 7.0). When the Eh of this same solution is increased, dihydroresorufin is oxidized back to resorufin, and this reversible reaction can be used to monitor if the redox potential of a culture medium remains at a sufficiently low level for anaerobic organisms.

Resazurin (pH indicator)
below pH 6.5 above pH 6.5
6.5 6.5

Resazurin solution has one of the highest values known of Kreft's dichromaticity index.[5] This means that it has a large change in perceived color hue when the thickness or concentration of observed sample increases or decreases.

Usually, resazurin is available commercially as the sodium salt.

Resazurin is reduced to resorufin by aerobic respiration of metabolically active cells, and it can be used as an indicator of cell viability. It was first used to quantify bacterial content in milk by Pesch and Simmert in 1929.[6] It can be used to detect the presence of viable cells in mammalian cell cultures.[7] It was introduced commercially initially under Alamar Blue trademark (Trek Diagnostic Systems, Inc), and now also available under other names such as AB assay, Vybrant (Molecular Probes) and UptiBlue (Interchim).

Resazurin based assays show excellent correlation to reference viability assays such as formazan-based assays (MTT/XTT) and tritiated thymidine based techniques.[8] The low toxicity makes it suitable for longer studies, and it has been applied for animal cells, bacteria, and fungi [8] for cell culture assays such as cell counting, cell survival, and cell proliferation.[9]

To take the place of a standard live/dead assay, resazurin also be multiplexed with chemiluminescent assays, such as cytokine assays, caspase assays to measure apoptosis, or reporter assays to measure a gene or a protein expression.[8]

The irreversible reaction of resazurin to resorufin is proportional to aerobic respiration.[10]

Resazurin Reduction Test

Resazurin can be used as one of a series of rapid tests to determine the quality of a milk sample. In this test, resazurin is added as a violet redox dye which turns mauvish-pink due to conversion to resorufin and then to colourless dihydroresorufin. This happens due to lowering of the oxidation-reduction potential in the milk sample caused by presence of bacteria which utilize available oxygen present in the milk for aerobic respiration. The rate of the colour change is used as an index for the number of bacteria present in the milk sample.[11]

 

Reduction of resazurin to resorufin, and reversible reduction of resorufin to dihydroresorufin.

Resazurin is effectively reduced in mitochondria, making it useful also to assess mitochondrial metabolic activity.

Usually, in the presence of NADPH dehydrogenase or NADH dehydrogenase as the enzyme, NADPH or NADH is the reductant that converts resazurin to resorufin. Hence the resazurin/diaphorase/NADPH system can be used to detect NADH, NADPH, or diaphorase level, and any biochemical or enzyme activity that is involved in a biochemical reaction generating NADH or NADPH.[12][13][14][15][16]

Resazurin can be used to assay L-Glutamate, achieving a sensitivity of 2.0 pmol per well in a 96 well plate.[17]

Resazurin can also be used to measure the aerobic biodegradation of organic matter found in effluents.[18]

Resazurin is used to measure the amount of aerobic respiration in streams.[19] Since most aerobic respiration occurs in the stream bed, the conversion of resazurin to resorufin is also a measure of the amount of exchange between the water column and the stream bed.

Resazurin is prepared by acid-catalyzed condensation between resorcinol and 4-nitrosoresorcinol followed by oxidation of the intermediate with manganese(IV) oxide:

 

Treatment of the crude reaction product with excess sodium carbonate yields the sodium salt of resazurin, which is typically the commercial form of the dye. Running the condensation step in alcohols is possible but results in lower yields of the product; in pure water or acetic acid, the reaction does not proceed satisfactorily.[20]

10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (also known as Amplex Red), structurally related to resazurin, reacts with H2O2 in a 1:1 stoichiometry to produce the same by-product resorufin (used in many assays combining for example horseradish peroxidase (HRP), or NADH, NADPH using enzymes).[21][22]

7-ethoxyresorufin, a compound used as the substrate in the measurement of cytochrome P450 (CYP1A1) induction using the ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) assay system in cell culture and environmental samples, produced in response to exposure to aryl hydrocarbons. The compound is catalysed by the enzyme to produce the same fluorescent product, resorufin.[23][24]

1,3-dichloro-7-hydroxy-9,9-dimethylacridin-2(9H)-one (DDAO dye), a fluorescent dye used for oligonucleotide labeling.[25]

  1. ^ "Resazurin | C12H7NO4 | ChemSpider".
  2. ^ Bueno, C.; Villegas, M. L.; Bertolotti, S. G.; Previtali, C. M.; Neumann, M. G.; Encinas, M. V. (2002). "The Excited-State Interaction of Resazurin and Resorufin with Aminesin Aqueous Solutions. Photophysics and Photochemical Reaction". Photochemistry and Photobiology. 76 (4): 385–90. doi:10.1562/0031-8655(2002)0760385TESIOR2.0.CO2. PMID 12405144. S2CID 222102027.
  3. ^ Haggerty, Roy; Martí, Eugènia; Argerich, Alba; Schiller, Daniel von; Grimm, Nancy B. (2009). "Resazurin as a "smart" tracer for quantifying metabolically active transient storage in stream ecosystems". Journal of Geophysical Research: Biogeosciences. 114 (G3). Bibcode:2009JGRG..114.3014H. doi:10.1029/2008JG000942. hdl:10261/38263. ISSN 2156-2202.
  4. ^ Chen, J. L., Steele, T. W., & Stuckey, D. C. (2015). Modeling and application of a rapid fluorescence-based assay for biotoxicity in anaerobic digestion. Environmental science & technology, 49(22), 13463-13471.http://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.est.5b03050
  5. ^ Kreft, Samo; Kreft, Marko (2009). "Quantification of dichromatism: A characteristic of color in transparent materials". Journal of the Optical Society of America A. 26 (7): 1576–81. Bibcode:2009JOSAA..26.1576K. doi:10.1364/JOSAA.26.001576. PMID 19568292.
  6. ^ Pesch, K. L.; Simmert, U. (1929). "Combined assays for lactose and galactose by enzymatic reactions". Milchw. Forsch. 8: 551.
  7. ^ Anoopkumar-Dukie, S; Carey, JB; Conere, T; O'Sullivan, E; Van Pelt, FN; Allshire, A (2005). "Resazurin assay of radiation response in cultured cells". British Journal of Radiology. 78 (934): 945–7. doi:10.1259/bjr/54004230. PMID 16177019.
  8. ^ a b c UptiBlue viable cell assay technical manual
  9. ^ Kurin, Elena; Atanasov, Atanas; Donath, Oliver; Heiss, Elke; Dirsch, Verena; Nagy, Milan (2012). "Synergy Study of the Inhibitory Potential of Red Wine Polyphenols on Vascular Smooth Muscle Cell Proliferation". Planta Medica. 78 (8): 772–8. doi:10.1055/s-0031-1298440. PMID 22499559.
  10. ^ González-Pinzón, Ricardo; Haggerty, Roy; Myrold, David D. (2012). "Measuring aerobic respiration in stream ecosystems using the resazurin-resorufin system" (PDF). Journal of Geophysical Research. 117 (G3): G00N06. Bibcode:2012JGRG..117.0N06G. doi:10.1029/2012JG001965.
  11. ^ Tortorello, Mary Lou, Batt, Carl A. Encyclopedia of food microbiology. ISBN 978-0-12-384733-1. OCLC 1049639465.
  12. ^ Shahangian, S.; Ash, K. O.; Rollins, D. E. (1984). "An Enzymatic Method for the Analysis of Formate in Human Plasma". Journal of Analytical Toxicology. 8 (6): 273–6. doi:10.1093/jat/8.6.273. PMID 6549198.
  13. ^ Hanson, NQ; Freier, EF (1983). "Effect of protein on the determination of total bile acids in serum". Clinical Chemistry. 29 (1): 171–5. doi:10.1093/clinchem/29.1.171. PMID 6571720.
  14. ^ De Jong, Donald W.; Woodlief, William G. (1977). "Fluorimetric assay of tobacco leaf dehydrogenases with resazurin". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Enzymology. 484 (2): 249–59. doi:10.1016/0005-2744(77)90081-X. PMID 20957.
  15. ^ Barnes, Stephen; Spenney, Jerry G. (1980). "Stoichiometry of the nadh-oxidoreductase reaction for dehydrogenase determinations". Clinica Chimica Acta. 107 (3): 149–54. doi:10.1016/0009-8981(80)90442-8. PMID 6893684.
  16. ^ Winartasaputra, H; Mallet, VN; Kuan, SS; Guilbault, GG (1980). "Fluorometric and colorimetric enzymic determination of triglycerides (triacylglycerols) in serum". Clinical Chemistry. 26 (5): 613–7. doi:10.1093/clinchem/26.5.613. PMID 6894889.
  17. ^ Chapman, Justin; Zhou, Mingjie (1999). "Microplate-based fluorometric methods for the enzymatic determination of l-glutamate: application in measuring l-glutamate in food samples". Analytica Chimica Acta. 402 (1–2): 47–52. doi:10.1016/S0003-2670(99)00533-4.
  18. ^ Jouanneau, S.; Recoules, L.; Durand, M.J; Boukabache, A.; Picot, V.; Primault, Y.; Lakel, A.; Sengelin, M.; Barillon, B.; Thouand, G. (2014). "Methods for assessing biochemical oxygen demand (BOD): A review". Water Research. 49: 62–82. doi:10.1016/j.watres.2013.10.066. PMID 24316182.
  19. ^ Haggerty, Roy; Martí, Eugènia; Argerich, Alba; Von Schiller, Daniel; Grimm, Nancy B. (2009). "Resazurin as a 'smart' tracer for quantifying metabolically active transient storage in stream ecosystems". Journal of Geophysical Research. 114 (G3): G03014. Bibcode:2009JGRG..114.3014H. doi:10.1029/2008JG000942. hdl:10261/38263.
  20. ^ A US 2376283 A, Frank Short Wallace & Peter Oxley, "Dyestuffs suitable for use as indicators", published 1945-05-15, assigned to Boots Pure Drug Co Ltd 
  21. ^ Zhou, M., Diwu, Z., Panchuk-Voloshina, N., et al. A stable nonfluorescent derivative of resorufin for the fluorometric determination of trace hydrogen peroxide: Applications in detecting the activity of phagocyte NADPH oxidase and other oxidases. Anal Biochem 253 162-168 (1997)
  22. ^ "10-Acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (CAS 119171-73-2) | Cayman Chemical".
  23. ^ Mohammadi-Bardbori, Afshin (2014). "Assay for quantitative determination of CYP1A1 enzyme activity using 7-Ethoxyresorufin as standard substrate (EROD assay)". Protocol Exchange. Research Square. 10 (5). doi:10.1038/protex.2014.043.
  24. ^ Chang, Thomas K.H.; Waxman, David J. (2005). "Enzymatic Analysis of cDNA-Expressed Human CYP1A1, CYP1A2, and CYP1B1 With 7-Ethoxyresorufin as Substrate". In Phillips, I.R.; Shephard, E.A. (eds.). Cytochrome P450 Protocols. Methods in Molecular Biology. Vol. 320 (2nd ed.). pp. 85–90. doi:10.1385/1-59259-998-2:85. ISBN 9781588294418. PMID 16719376.
  25. ^ Dominiak, D.M.; Nielsen, J.L.; Nielsen, P.H. (2010). "Extracellular DNA is abundant and important for microcolony strength in mixed microbial biofilms". Environmental Microbiology. 13 (3): 710–721. doi:10.1111/j.1462-2920.2010.02375.x. PMID 21118344.

Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Resazurin&oldid=1095881908"

Tải thêm tài liệu liên quan đến bài viết Resazurin là gì