Resazurin là gì
|
VÀ PHƯƠNG PHÁP KIỂMNGHIỆM VI SINH VẬTTRONG NHÀ MÁY SỮA1GVHD : LÊ LÝ THÙY TRÂMSVTH : NGUYỄN ĐOÀN THANH DUNGNGUYỄN THỊ DIỆU HƯƠNGVĂN THỊ THU NGUYỆTTRẦN THỊ NHI2I. GIỚI THIỆU VỀ SỮA :1.Sữa là gì?Sữa là một chất lỏng màu trắng đục được tạo ra bởi con cáicủa động vật có vú, là nguồn dinh dưỡng ban đầu cho connon mới sinh.32.Chất dinh dưỡng có trong sữa :4Thành phần dinh dưỡng trong 100ml sữa mẹ và sữa bò53.Phân loại sữa:6II.HỆ VI SINH VẬT TRONG SỮA1. Nguồn gốc2.Hệ vi sinh vật trong sữaĐược chia thành 2 nhóm chính: Procaryote vàEucaryote7ProcaryoteEucaryote Nhân chưa hoàn chỉnh Nhân hoàn chỉnhVùng nhân chỉ là mạch ADN xoắn kép nằm trong tế bào chất, lưu giữ các thông tin di truyền cho tế bàoNằm trong tế bào chất, nhân được bao bọc bởi màn nhân, bên trong là các nhiễm sắc thể lưu giữ thông tin di truyềnĐại diện : vi khuẩnĐại diện : nấm men và nấm sợiCác vi khuẩn thường gặp : + Vi khuẩn lactic + Coliform + Vi khuẩn sinh acid butyric + Vi khuẩn sinh acid propionic . + Các vi khuẩn gây thối83.Vi sinh vật chỉ thị9III/ CÁC CHỈ TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁPKIỂM NGHIỆM VI SINH VẬT TRONG NHÀMÁY SỮA:10111. Chất chỉ thị xanh Metylena) Nguyên tắc:Các vi sinh vật ô nhiễm sữa khi phát triển là thay đổi hiệuthế oxi hóa khử, nếu cho chất chỉ thị xanh metylen vào sữasẽ làm thay đổi màu xanh metylen, tùy theo màu thay đổivà thời gian thay đổi màu có thể tính được mức độ nhiễmvi sinh vật của sữa.b) Cách tiến hành:12Ống nghiệm: 10 ml mẫu sữa + 1 ml xanh metylen 0.5%Đậy nắp ống nghiệm, trộn đềuĐể ống nghiệm vào tủ ấm 37 ± 10oCNhiệt độ trong ống sữa đạt 3840oC bắt đầu tính thời gianThời gian mất màu xanh methylen = giờ kết thúc – giờ bắt đầuKhi màu xanh của ống nghiệm chuyển sang màu trắng, còn lại khoảng 1cm chiều cao có màu xanh nhạt => đọc giờ kết thúc13c) Kết quả:Thời gian mất màuMức độ nhiễm vsv< 15 phútnhiễm rất nhiều vsv15p – 1 giờô nhiễm nặng1 – 3 giờô nhiễm nhẹ> 3 giờđạt chuẩn vsv142. Chất chỉ thị Resazurin:a) Nguyên tắc:-Sựthay đổi màu của chất chỉ thị này theo thời gian phụthuộc vào sự hoạt động của vsv hiện diện trong sữaĐiềuđó có nghĩa là phản ứng với resazurin cho ta biếtmức độ hoạt động của vsv hơn là số lượng của chúng.b) Cách tiến hành:15Ống nghiệm: 10 ml mẫu sữa + 1 ml resazurinĐặt vào nồi cách thủy 37 38oCSau khi đạt nhiệt độ trên, bắt đầu tính giờXem xét sự thay đổi màu16c) Kết quả: Thời gian mấtmàu=< 20 phútSự thay đổi màu Chất lượng sữaTrắngRất nhiều vsvSau 1 giờHồngÔ nhiễm nặngSau 1 giờXanh-tímÔ nhiễm nhẹSau 1 giờXanh( không đổimàu)Đạt chuẩn vsv173. Xác định tổng lượng vi sinh vật hiếu khí:a) Nguyên tắc: Cấy một thể tích xác định huyền phù cần nghiên cứu vàomôi trường dinh dưỡng. Đếm số khuẩn lạc mọc lên trên cơsở xem một khuẩn lạc là một sinh khối phát triển từ một tếbào hiện diện trong mẫu.b) Cách tiến hành:18Đồng nhất và pha loãng mẫu để có độpha loãng 101,102,10-3,10-4…Chọn 2 nồng độ pha loãng thích hợp,chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vôtrùng (mỗi nồng độ cấy2 đĩa)Rót vào mỗi đĩa petri 10-15ml môi trường PCA đã được làm nguội đến45°C, lắc cho mẫu phân tán đều vào môi trường, ủ ở 30°C trong 72 giờChọn các đĩa có số khuẩn lạc trongkhoảng 25-250 khuẩn lạc/đĩa để đếmTính tổng số vsv hiếu khí19Công thức:Trong đó: -A: số tế bào VK trong 1g hay 1ml mẫu -N: số khuẩn lạc đếm được rên các đĩa đã chọn -n: số đĩa cấy tại độ pha loãng thứ nhất -V: thể tích mẫu (ml) cấy vào đĩa -f: độ pha loãng tương ứng20c) Kết quả:Số khuẩn lạcChất lượng sữa105 tế bào/g(ml)sữa bị chua106-107 tế bào/g(ml)sữa có mùi hôi108 tế bào/g(ml)có mùi hôi không chấpnhận được109-1010 tế bào/g(ml)sữa thay đổi cấu trúc214. Xác định sự lên men:a) Nguyên tắc:Dựa vào sự thay đổi màu sắc, sinh hơi của môi trường PRBvà mẫu trong ống Durhamb) Cách tiến hành:22Chuẩn bị thử, pha loãng mẫu 101. Tiến hành với mẫu 100 và 101Dùng pipet vô trùng lấy 0.1 mlmẫu dung dịch thứ cho vào ốngnghiệm chứa môi trường PRB tiệttrùng, lắc đều.Cho vào tủ ấm 32±1°C ủ trong 24đến 48±3 giờ.Xem kết quả23c) Kết quả: Dương Màu môi trường chuyển từ đỏ sangtínhvàng và sinh hơi trong ốngDurham.Âm tínhMôi trường màu đỏ, có thể chuyểnsang màu vàng nhưng không sinhhơi trong ống Durham.245. Xác định Staphylococcus aureus:a) Nguyên tắc:Staphylococcus aureus được xác định cơ sở các đặc điểmtăng trưởng và phản ứng đông huyết tương của các dòngthuần từ các khuẩn lạc đặc trưng trên môi trường phân lập.b) Cách tiến hành:25 Resazurin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one 10-oxide) is a phenoxazine dye that is weakly fluorescent, nontoxic, cell-permeable, and redox‐sensitive.[2][3] Resazurin has a blue to purple color (at pH > 6.5) and is used in microbiological, cellular, and enzymatic assays because it can be irreversibly reduced to the pink-colored and highly fluorescent resorufin (7-Hydroxy-3H-phenoxazin-3-one). At circum-neutral pH, resorufin can be detected by visual observation of its pink color or by fluorimetry, with an excitation maximum at 530-570 nm and an emission maximum at 580-590 nm.[4] 7-hydroxy-10-oxidophenoxazin-10-ium-3-one Alamar Blue, Vybrant, UptiBlue, diazo-resorcinol, azoresorcin, resazoin, resazurine CAS Number 3D model (JSmol)
 PubChem CID
CompTox Dashboard (EPA)
InChI
SMILES
Chemical formula C12H7NO4Molar mass 229.191 g·mol−1Solubility in water soluble Hazards GHS labelling:Pictograms Signal word WarningHazard statements H315, H319, H335Precautionary statements P261, P305+P351+P338 NFPA 704 (fire diamond)
2 1 0 Except where otherwise noted, data are given for materials in their standard state (at 25 °C [77 °F], 100 kPa). Infobox references When a solution containing resorufin is submitted to reducing conditions (Eh < -110 mV), almost all resorufin is reversibly reduced to the translucid non-fluorescent dihydroresorufin (sin. hydroresorufin) and the solution becomes translucid (the redox potential of the resorufin/dihydroresorufin pair is -51 mV vs. standard hydrogen electrode at pH 7.0). When the Eh of this same solution is increased, dihydroresorufin is oxidized back to resorufin, and this reversible reaction can be used to monitor if the redox potential of a culture medium remains at a sufficiently low level for anaerobic organisms.
Resazurin solution has one of the highest values known of Kreft's dichromaticity index.[5] This means that it has a large change in perceived color hue when the thickness or concentration of observed sample increases or decreases. Usually, resazurin is available commercially as the sodium salt. Resazurin is reduced to resorufin by aerobic respiration of metabolically active cells, and it can be used as an indicator of cell viability. It was first used to quantify bacterial content in milk by Pesch and Simmert in 1929.[6] It can be used to detect the presence of viable cells in mammalian cell cultures.[7] It was introduced commercially initially under Alamar Blue trademark (Trek Diagnostic Systems, Inc), and now also available under other names such as AB assay, Vybrant (Molecular Probes) and UptiBlue (Interchim). Resazurin based assays show excellent correlation to reference viability assays such as formazan-based assays (MTT/XTT) and tritiated thymidine based techniques.[8] The low toxicity makes it suitable for longer studies, and it has been applied for animal cells, bacteria, and fungi [8] for cell culture assays such as cell counting, cell survival, and cell proliferation.[9] To take the place of a standard live/dead assay, resazurin also be multiplexed with chemiluminescent assays, such as cytokine assays, caspase assays to measure apoptosis, or reporter assays to measure a gene or a protein expression.[8] The irreversible reaction of resazurin to resorufin is proportional to aerobic respiration.[10]
Resazurin Reduction TestResazurin can be used as one of a series of rapid tests to determine the quality of a milk sample. In this test, resazurin is added as a violet redox dye which turns mauvish-pink due to conversion to resorufin and then to colourless dihydroresorufin. This happens due to lowering of the oxidation-reduction potential in the milk sample caused by presence of bacteria which utilize available oxygen present in the milk for aerobic respiration. The rate of the colour change is used as an index for the number of bacteria present in the milk sample.[11] Reduction of resazurin to resorufin, and reversible reduction of resorufin to dihydroresorufin. Resazurin is effectively reduced in mitochondria, making it useful also to assess mitochondrial metabolic activity. Usually, in the presence of NADPH dehydrogenase or NADH dehydrogenase as the enzyme, NADPH or NADH is the reductant that converts resazurin to resorufin. Hence the resazurin/diaphorase/NADPH system can be used to detect NADH, NADPH, or diaphorase level, and any biochemical or enzyme activity that is involved in a biochemical reaction generating NADH or NADPH.[12][13][14][15][16] Resazurin can be used to assay L-Glutamate, achieving a sensitivity of 2.0 pmol per well in a 96 well plate.[17] Resazurin can also be used to measure the aerobic biodegradation of organic matter found in effluents.[18] Resazurin is used to measure the amount of aerobic respiration in streams.[19] Since most aerobic respiration occurs in the stream bed, the conversion of resazurin to resorufin is also a measure of the amount of exchange between the water column and the stream bed. Resazurin is prepared by acid-catalyzed condensation between resorcinol and 4-nitrosoresorcinol followed by oxidation of the intermediate with manganese(IV) oxide:
Treatment of the crude reaction product with excess sodium carbonate yields the sodium salt of resazurin, which is typically the commercial form of the dye. Running the condensation step in alcohols is possible but results in lower yields of the product; in pure water or acetic acid, the reaction does not proceed satisfactorily.[20] 10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine (also known as Amplex Red), structurally related to resazurin, reacts with H2O2 in a 1:1 stoichiometry to produce the same by-product resorufin (used in many assays combining for example horseradish peroxidase (HRP), or NADH, NADPH using enzymes).[21][22] 7-ethoxyresorufin, a compound used as the substrate in the measurement of cytochrome P450 (CYP1A1) induction using the ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) assay system in cell culture and environmental samples, produced in response to exposure to aryl hydrocarbons. The compound is catalysed by the enzyme to produce the same fluorescent product, resorufin.[23][24] 1,3-dichloro-7-hydroxy-9,9-dimethylacridin-2(9H)-one (DDAO dye), a fluorescent dye used for oligonucleotide labeling.[25]
|
